編輯GTF/GFF：篩選出特定基因註解資料

目的

從GTF/GFF全基因組註解（genome annotation）資料，根據給定基因列表，篩選出這些基因的所有註解條目。

準備資料

小鼠全基因組註解檔案「Mus_musculus.GRCm38.88.gtf」
- 本次範例使用Ensembl release 88版本
- 下載網址：https://ftp.ensembl.org/pub/release-88/gtf/mus_musculus/
基因ID列表
- 本範例目的為：篩選出所有 HoxD 基因的註解條目
- 每一行只輸入一個基因ID
- 由上到下對應的分別是 HoxD1、HoxD3、HoxD4、HoxD8、HoxD9、HoxD10、HoxD11、HoxD12、HoxD13

ENSMUSG00000042448
ENSMUSG00000079277
ENSMUSG00000101174
ENSMUSG00000027102
ENSMUSG00000043342
ENSMUSG00000050368
ENSMUSG00000042499
ENSMUSG00000001823
ENSMUSG00000001819

解決方案

利用 AGAT 工具。AGAT 提供多種檢視、處理、編輯GTF/GFF檔案的工具。雖然GTF/GFF有統一格式（皆包含9列資料），但是不同基因組註解工具所得到的結果卻有可能不盡相同，在後續基因組學分析中，某些生物資訊學工具可能無法辨識某些註解資料（尤其第9列中的不同attributes），或由於註解檔案缺少某些項目（例如沒有標註為gene的條目或者缺少biotype標記）而無法進行後續分析。為解決此問題（或相關的基因組學問題），AGAT工具可以協助編輯全基因組註解檔案。

本次利用AGAT工具包中的「agat_sp_filter_feature_from_keep_list.pl」，可篩選出只與列表中基因相關的條目。工具包中亦有相反功能的「agat_sp_filter_feature_from_kill_list.pl」，可篩選出給定基因列表以外的所有條目。使用方法如下：

agat_sp_filter_feature_from_keep_list.pl \
  --gff infile.gff \
  --keep_list file.txt  \
  [--output outfile]

［步驟１］利用Docker安裝AGAT工具

啟動Docker（macOS版本）
以command line下載AGAT（目前最新版本為0.8.0）：

docker pull quay.io/biocontainers/agat:0.8.0--pl5262hdfd78af_0

下載完成可在Docker畫面中看到工具包：

下載AGAT的Docker版本

［步驟２］設定所需memory

編輯GTF/GFF文件對memory需求比較大，Docker預設只有2GB，一般在讀取基因組註解檔案中途便會用光，然後Docker會強制中斷運行。
本次實驗把memory設定為30GB時，讀取小鼠基因組註解GTF檔案到達95%時還是把memory用完了。最後調至40GB左右才完成讀取及編輯。
對於基因組註解比較完善的物種（小鼠、人），對memory的需求比較大。若電腦沒有足夠memory，可考慮把GTF檔案切成2-3部分，再分別對每一部分進行編輯。

設定Docker記憶體上限

［步驟３］運行Docker版本AGAT工具

建立涉及之資料夾
利用command line執行編輯GTF指令，AGAT會偵測輸入檔案是GTF (GFF version 2) 還是GFF3格式再進行讀取，輸出檔案預設是GFF3格式：

docker run --rm -it \
    -v PATH_WHERE_YOUR_DATA_IS_STORED:PATH_WHERE_YOUR_DATA_IS_STORED \
    quay.io/biocontainers/agat:0.8.0--pl5262hdfd78af_0  \
    bash -c 'cd PATH_WHERE_YOUR_DATA_IS_STORED \
      && /usr/local/bin/agat_sp_filter_feature_from_keep_list.pl \
      --gff ANNOTATION.GTF \
      --keep_list GENE_LIST.txt \
      --output ANNOTATION.filtered.gff3'

本次實驗的輸出檔案共177行(wc -l)，包括首行標示該檔案為GFF3格式，以及9個Hox基因的註解。
對於註解較為完善的物種（例如小鼠），運行時間可能超過半小時。由於Docker啟動時會預留已設定的memory（例如上圖30GB），等待編輯結果時請儘量避免同時運行其他bioinformatics工具。

篩選後的註解文件GFF3

參考資料

Dainat, J. & Hereñú, D. AGAT: Another Gff Analysis Toolkit to handle annotations in any GTF/GFF format (version v0.8.0). Zenodo (2021). doi:10.5281/zenodo.3552717

BIOLOGIST J